Cloning and expression of meta-cleavage enzyme (CarB) of carbazole degradation pathway from Pseudomonas stutzeri

Brazilian Archives of Biology and Technology

卷:48

关键词: Carbazole;    2'-aminobiphenyl-2,3-diol dioxygenase;    HOADA;    heterologous gene expression;    petroleum denitrogenation;    biodegradation;   

DOI  :  10.1590/S1516-89132005000400016

来源: DOAJ

【 摘 要 】

In this work, the 1082bp PCR product corresponding to carBaBb genes that encode the heterotetrameric enzyme 2'-aminobiphenyl-2,3-diol 1,2-dioxygenase (CarB), involved in the Pseudomonas stutzeri ATCC 31258 carbazole degradation pathway, was cloned using the site-specific recombination system. Recombinant clones were confirmed by PCR, restriction enzyme digestion and sequencing. CarB dioxygenase was expressed in high levels and in active form in Escherichia coli BL21-SI using the His-tagged expression vector pDEST TM17 and salt induction for 4h.
Carbazol e seus derivados são compostos nitrogenados aromáticos, presentes comumente em petróleo e potencialmente poluentes. A rota de biodegradação de carbazol a ácido antranílico em Pseudomonas sp. é composta por três enzimas responsáveis, respectivamente, pelas reações de dioxigenação angular, meta-clivagem e hidrólise. A segunda enzima da rota, 2'-aminobifenil-2,3-diol 1,2-dioxigenase (CarB), codificada por dois genes (carBa e carBb), é um heterotetrâmero com atividade catalítica na quebra do anel catecol do susbtrato na posição meta. Neste trabalho, foi clonado o produto de PCR de 1082pb correspondente aos genes carBaBb da bactéria degradadora de carbazol Pseudomonas stutzeri ATCC 31258. A estratégia de clonagem empregada foi a de recombinação sítio-específica e a construção dos plasmídeos foi confirmada por PCR, digestão com enzima de restrição e seqüenciamento. A enzima ativa foi expressa em altas concentrações em vetor pDEST TM17 com cauda de histidina e promotor T7 em Escherichia coli BL21-SI com indução por NaCl durante 4h.

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