Conjugação e validação de controle isotípico IgG1-FITC para uso em citometria de fluxo

Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia

Márjorie A. Golim²  Elenice Deffune¹  Rosana Rossi-ferreira¹  Ana Paula E. Oliveira¹  Carlos Roberto Padovani¹  Paulo Eduardo A. Machado¹ 

[1] ,Unesp Faculdade de Medicina de Botucatu

关键词: Controle isotípico;    citometria de fluxo;    anticorpo monoclonal;    isotiocianato de fluoresceína (FITC);    Isotype control;    flow cytometry;    monoclonal antibody;    fluorescein isothiocyanate (FITC);   

DOI  :  10.1590/S1516-84842007000400008

来源: SciELO

【 摘 要 】

Em meados da década de 50 iniciou-se o desenvolvimento da citometria de fluxo, tecnologia que permite verificar características físico-químicas de células ou partículas suspensas em meio fluido. Esta tecnologia utiliza anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos como ferramenta de investigação em diversas análises e necessita de controles isotípicos para definição da região negativa (background). Estes controles são constituídos por imunoglobulinas de mesmo isotipo e fluorocromo dos anticorpos testes, sendo o isotiocianato de fluoresceína (FITC) o marcador fluorescente mais utilizado na conjugação de anticorpos. Os controles isotípicos têm como função definir a fluorescência inespecífica (células negativas) e as regiões fluorescentes (células positivas). No presente estudo foi selecionado anticorpo monoclonal murino (AcMm) dirigido contra antígeno eritrocitário canino, produzido no Laboratório de Anticorpos Monoclonais do Hemocentro de Botucatu, o qual reage positivamente com hemácias de cães, mas nunca com leucócitos humanos, tendo, portanto, potencial utilidade como controle negativo em citometria de fluxo. A purificação do AcMm da subclasse IgG1 foi feita por cromatografia de afinidade em Proteína-A Sepharose, e o controle da purificação realizado por eletroforese em géis de ágarose e poliacrilamida (SDS-PAGE). A imunoglobulina purificada foi conjugada ao FITC e filtrado em coluna de Sephadex G-25 para separação das proteínas marcadas e não-marcadas. O AcMm conjugado foi testado contra hemácias de cães, e o êxito da conjugação comprovado por testes de fluorescência, sendo a mediana de positividade de 94,70. Frente a leucócitos humanos a mediana de positividade foi 0,03 contra 0,50 dos reagentes comerciais. Os testes estatísticos não-paramétricos de Wilcoxon e correlação de Spearman comprovaram a eficiência e validam o controle isotípico produzido em comparação aos reagentes comerciais testados.

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