Oregano, rosemery, cinnamon essential oil and pepper extract to control Salmonella, Eimeria and Clostridium in broiler chickens

Pesquisa Veterinária Brasileira

Santin, Elizabeth¹  Vasconcelos, Sâmara P.¹  Pickler, Larissa¹  Bona, Tânia D.M.M.¹  Miglino, Leonardo B.¹  Kuritza, Leandro N.¹ 

[1] Universidade Federal do Paraná, Curitiba, Brasil

关键词: CD3+ cells;    coccidiosis;    plant extracts;    essential oils.;   

DOI  :  10.1590/S0100-736X2012000500009

来源: Colegio Brasileiro de Patologia Animal-CBPA

【 摘 要 】

The efficiency of a product in broiler feed containing essential oil of oregano, rosemary, cinnamon and extract of red pepper (plant compost) in the control of Salmonella, Eimeria and Clostridium was evaluated. Two experiments were carried out to evaluate the product. In the first experiment the efficiency of this product to control Clostridium perfringens after challenge with Eimeria acervulina, E. maxima and E. tenella was assessed. Day old chicks were allotted into three groups: T1 - control diet without growth promoter, T2 - diet with avilamycin (10ppm), and T3 - diet with addition of the plant compost (100ppm). The use of the plant compost in broiler diets reduced specific lesions of E. maxima and E. tenella at 14 days after inoculation and reduced the count of colony forming units (CFU) of Clostridium perfringens in the ceca comparing to the control group. In the second trial the efficiency of the same product in birds challenged with Salmonella Enteritidis was evaluated. Day old birds were submitted to three experimental diets: T1 - control diet without antibiotics growth promoter, T2 - diet with 10ppm Avilamycin, T3 - diet with 100ppm of the plant compost mentioned above. At 21 days of age all birds were inoculated with 105 CFU of Salmonella Enteritidis. The use of the plant compost and avilamycin decreased the excretion of Salmonella in poultry 72 hours after the inoculation. The use of the plant compost increased villous/CD3+ cells in the duodenum, compared to group avilamycin and control, but had no effect on the expression of these cells in the cecum. Index terms: CD3+ cells, coccidiosis, plant extracts, essential oils.    INTRODUÇÃO Óleos essenciais constituem-se em complexas misturas de substâncias voláteis, geralmente lipofílicas (Simões & Spitzer 1999), cujos componentes incluem hidrocarbonetos terpênicos, álcoois simples, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, ácidos orgânicos fixos, etc, em diferentes concentrações, nos quais, um composto farmacologicamente ativo é majoritário. No orégano, este composto é o carvacrol (3-17%); e, na canela, o cinamaldeído (75%) (Farmacopea Italiana 1998). Como mecanismo de ação dos óleos essenciais acredita-se que a maioria deles exerce efeito antimicrobiano na estrutura da parede celular bacteriana, desnaturando e coagulando proteínas. Alteram a permeabilidade da membrana citoplasmática para íons de hidrogênio e potássio, causando a interrupção dos processos vitais da célula, como transporte de elétrons, translocação de proteínas, fosforilação e outras reações que dependem de enzimas, o que resulta em perda do controle quimiosmótico da célula afetada, levando a morte bacteriana (Dorman & Deans 2000). A coccidiose é uma das doenças aviárias causada por protozoários do gênero Eimeria, presente em praticamente todos os plantéis avícolas. Causa prejuízos, tanto pelo aumento da conversão alimentar, diminuição na taxa de crescimento e, às vezes, por aumentar a mortalidade nos lotes (Mc Dougald 1998), quanto por ser também um fator predisponente ao surgimento de clostridiose, por danificar os tecidos intestinais e modificar as funções do trato gastrointestinal quebrando as barreiras naturais de defesa do animal (Gil de los Santos et al. 2008). As principais eimérias que causam problemas em avicultura são a Eimeria acervulina que provoca principalmente lesões em duodeno, a E. maxima que causa lesões em jejuno e íleo e a E. tenella que causa processos hemorrágicos no ceco das aves. Embora o uso de anticoccidianos seja eficiente no controle da doença o aparecimento de resistência limita seu uso na eliminação da doença em granjas comerciais, em vista disso estudam-se alternativas para o controle desta enfermidade, como óleos essenciais e extratos vegetais. Christaki et al. (2004) obtiveram resultados positivos com relação ao desempenho zootécnico (ganho de peso, consumo de ração e conversão alimentar) além de observarem uma redução nas lesões em ceco dos animais tratados com mistura comercial de óleos essenciais em frangos desafiados com Eimeria tenella. Clostridium perfringens participa da microbiota intestinal normal de frangos, porém, alguns fatores como mudanças bruscas na alimentação, stress, salmoneloses, micotoxinas e coccidiose fazem em com que este micro-organismo reproduza-se rapidamente produzindo toxinas que causam lesões ulcerativas e necrose da mucosa intestinal levando a uma doença conhecida como enterite necrótica (Saif 2008). Estima-se que esta doença possa causar perdas da ordem de até 33% nos plantéis avícolas devido aos gastos com medicamentos, redução no ganho de peso e aumento da conversão alimentar (Lovland & Kaldhusdal 2001). A capsaicina, o cinamaldeído e o carvacrol podem reduzir o número de C. perfringens em ceco de frangos (Jamroz & Kamel 2002), bem como uma mistura de óleos essenciais a base de carvacrol, timol, cinamaldeído, eugenol e capsaicina reduziu a contagem desta bactéria em duodeno, jejuno, íleo e ceco de frangos (Mitsch et al. 2004). A salmonelose é uma zoonose de importância mundial que preocupa as autoridades sanitárias e se constitui em importante barreira ao comércio internacional de alimentos. A ampla distribuição de Salmonella entre os animais e sua capacidade de sobreviver por longos períodos no meio ambiente contribuem para seu destacado papel em saúde pública (Butaye et al. 2003). O gênero Salmonella pertence à família Enterobacteriaceae e compreende as espécies S. enterica e S. bongori; a espécie S. enterica alberga as linhagens patogênicas distribuídas em seis subespécies e 2.564 sorovares, todas patogênicas ao homem (Bopp et al. 2003) onde inclue-se a Salmonella Enteritidis (SE). Neste contexto, aumenta a importância da exploração do potencial antimicrobiano, bem como de outras propriedades, das plantas e de seus respectivos constituintes. Este trabalho foi dividido em dois experimentos sendo que o primeiro teve como objetivo avaliar a eficiência de óleo essencial de orégano, alecrim, canela e extrato pimenta vermelha, no controle da coccidiose e de Clostridium perfringens em frangos desafiados com Eimeria acervulina, E. maxima e E. tenella e o segundo experimento teve o objetivo de avaliar a eficiência antimicrobiana deste mesmo produto em aves desafiadas com Salmonella Enteritidis, além de avaliar a morfometria intestinal e a presença de células CD3+ (linfócitos T) na mucosa intestinal.   MATERIAL E MÉTODOS Experimento 1 Foram alojadas 51 frangos de corte linhagem Cobb 500® de um dia de idade em cama de maravalha, divididas em três grupos sendo 17 animais por tratamento. Cada tratamento recebeu ração formulada de acordo com os níveis recomendados pelo NRC (1994) sem adição de coccidiostático, sendo que o T1 recebeu dieta controle sem adição de antibiótico promotor de crescimento (APC), T2 dieta com adição de 10ppm de avilamicina, e T3 dieta com adição de 100ppm de composto vegetal sendo uma mistura comercial a base de óleos essenciais de orégano (carvacrol), alecrim (cineol), canela (cinamaldeído) e extrato de pimenta vermelha (capsaicina). Os níveis dos produtos adicionados nas rações seguiram as recomendações dos fabricantes. Cada dieta foi fornecida do primeiro ao último dia do experimento. O composto vegetal possui óleo essencial de orégano (Origanum vulgare), canela (Cinnamomum zeylanicum) e alecrim (Rosmarinus officinallis) e extrato de pimenta vermelha (Capsicum annuum) e apresenta garantias mínimas de 4,5mg/kg de carvacrol, 1,0g/kg de cinamaldeído, 2,0g/kg de cineol e 20g/kg de capsaicina. De acordo com o FDA (Code of Federal Regulations 21 CFR 172.515, 2008; 21 CFR 582.10, 2001) estas matérias primas são consideradas seguras e inócuas para animais e seres humanos. Foi realizada necropsia de cinco aves por tratamento aos nove dias de idade para coleta de fragmentos de fígado sendo fixado em solução formalina tamponada a 10%. As amostras foram processadas e coradas com Hematoxilina e Eosina (HE) para análise histológica utilizando microscópio óptico.Aos 15 dias de idade os animais receberam 1,8mL de inóculo por via oral, com seringa acoplada em sonda, com pool de oocistos esporulados de Eimeria acervulina (200x103), E. maxima (50x103) e E. tenella (10x103). Os oocistos foram obtidos de cepas de campo replicados de acordo com Costa & Paiva (2007). Aos 22 e 29 dias de idade (7 e 14 dias pós -inoculação), foi realizada a eutanásia e necropsia de 36 aves, sendo 18 aos 22 dias e 18 aos 29 dias de idade (seis aves por tratamento) para avaliação intestinal de lesões de coccidiose e enterites inespecíficas. As lesões de coccidiose foram avaliadas segundo os escores de lesão definidos por Johnson & Reid (1970) (Grau 0 - sem lesão; Grau 1 - lesão leve; Grau 2 - lesão moderada; Grau 3 - lesão severa; Grau 4 - lesão muito severa), e as lesões de enterites inespecíficas foram classificadas em escores de acordo com Saad (2009) (Grau 0 - sem lesão; Grau 1 - lesão leve; Grau 2 - lesão moderada; Grau 3 - lesão severa).Na segunda coleta, 14 dias pós-inoculação, também foram coletados conteúdo cecal para contagem de Clostriduim perfringens. Para o procedimento de contagem de Clostridium perfringens foi adicionado 1,0g de conteúdo cecal em 9mL de solução fisiológica estéril, desta diluição retirou-se 1 mL sendo pipetado em um tubo com 9,0mL de solução fisiológica estéril e assim sucessivamente até a diluição 10-4. Retirou-se 100µL de cada diluição e foi espalhado em placas de Reinforced Clostridium Agar (Himedia®) enriquecido com sangue de carneiro em duplicata. As placas foram incubadas em jarra de anaerobiose (Oxoid®) e levadas a estufa regulada a 35ºC por 24 horas. Foi verificado o crescimento de colônias típicas de Clostridium perfringens que apresentavam um halo de beta-hemólise sendo confirmadas pela coloração de Gram. Posteriormente, as colônias foram contadas e os resultados foram expressos de acordo com Procedimentos de Contagem de Colônia de acordo com a Normativa nº6 publicada em 26 de agosto de 2003 (MAPA).A contagem das colônias de Clostridium foi transformada em Log10 para converter os dados em distribuição normal para realização da análise estatística. A contagem de colônias de Clostridium e escores de lesão foram analisados no programa StatView for Windows Copyright© 1998 (SAS Institute Inc., NC, USA) com ANOVA e teste de Post Hoc de Fischer com significância menor que 0,05. Experimento 2 Foram alojadas 24 frangos de corte linhagem Cobb 500® de um dia de idade, distribuídas em um desenho experimental inteiramente casualizado com três tratamentos e oito repetições, sendo cada ave uma repetição. Cada tratamento recebeu ração formulada de acordo com os níveis recomendados pelo NRC (1994) sem adição de coccidiostático, sendo que o T1 recebeu dieta controle sem adição de antibiótico promotor de crescimento, T2 dieta contendo 10ppm de Avilamicina, T3 dieta contendo 100ppm de composto vegetal sendo uma mistura comercial a base de óleos essenciais de orégano (carvacrol), alecrim (cineol), canela (cinamaldeído) e extrato de pimenta vermelha (capsaicina). Os níveis dos produtos adicionados nas rações seguiram as recomendações dos fabricantes. Cada dieta foi fornecida durante todos os dias do experimento. O composto vegetal adicionado na ração era o mesmo fornecido no primeiro experimento. Aos 21 dias de idade todas as aves receberam 1,0mL de inóculo via oral contendo 105 UFC/mL de SE, com o uso de seringa acoplada em sonda diretamente no esôfago das aves.Swabs de cloaca de todos os animais foram coletados às 24, 48 e 72 horas pós-inoculação e as amostras foram processadas para contagem de Salmonella. Para o procedimento de contagem de Salmonella os swabs cloacais foram colocados em tubos contendo 2,0mL de água peptonada 2%. Foram retirados 1,0mL desta solução e pipetados em tubo contendo 9,0mL de água peptonada 0,1% (diluição 10-1) e assim sucessivamente até as diluições 10-2 e 10-3. Foi retirado 100µL de cada diluição e plaqueado em duplicata em meio Lisina Xilose Desoxicolato (XLD). As placas foram incubadas em estufa regulada a 35ºC por 24h para posterior contagem das colônias (adaptado de Desmidt et al. 1998). Os resultados foram expressos de acordo com Procedimentos de Contagem de Colônia de acordo com a Normativa nº 62 publicada em 26 de agosto de 2003 (Brasil - MAPA). Os tubos contendo os swabs e a água peptonada 2% foram incubados a 35ºC por 24h. Quando não havia a presença de colônias típicas de Salmonella nas placas após 24h de incubação, era retirado 100 µL da solução de suabe em água peptonada 2% e acrescido em tubo contendo 10mL de caldo Rappaport-Vassiliadis, sendo então incubado em estufa regulada a 42ºC por 24h para confirmação da presença ou ausência de Salmonella. Aos 24 dias de vida das aves (terceiro dia após a inoculação) oito aves de cada tratamento foram eutanasiadas por deslocamento cervical e necropsiadas. Foram coletados fragmentos de duodeno, íleo e ceco, em solução formalina tamponada a 10%, para avaliação histológica, morfométrica e imuno-histoquímica (duodeno e ceco). As amostras de duodeno, íleo e ceco foram processadas e coradas com Hematoxilina e Eosina (HE) e Alcian Blue para análise histológica (Luna 1968). As variáveis estudadas nos intestinos foram altura dos vilos, profundidade das criptas, contagem de células caliciformes (coradas em azul), com leitura em aumento de 40x de 20 vilos e criptas em cada grupo experimental (adaptado de Maiorka et al. 2000). As análises morfométricas do epitélio intestinal foram feitas em microscopia de luz, em sistema analisador de imagens acoplado ao microscópio óptico. Após a obtenção dos dados, foi realizada a relação vilo/células caliciformes e vilo/cripta. Fragmentos de duodeno e ceco também foram coletados para realização de imuno-histoquímica. Para o procedimento de imuno-histoquímica foi realizada a recuperação antigênica colocando-se as amostras em solução Tampão Citrato pH 6,0 em microondas por 10 minutos. Na sequência, as amostras receberam anticorpo policlonal desenvolvido em coelhos como anticorpo primário anti-CD3 (DAKO Corporation, CA, USA), diluído 1:750, por 40 minutos em temperatura ambiente. Para detecção da reação foi utilizado anticorpos secundários anti-camundongo e anti-coelho combinados num mesmo sistema de amplificação (Kit ADVANCE® - DAKO Corporation, CA, USA) por 40 minutos em temperatura ambiente. Para revelação utilizou-se cromógeno (Kit DAB® - DAKO Corporation, CA, USA) por 5 minutos. A contra-coloração foi realizada com hematoxilina Meyer por um minuto. As análises imuno-histoquímicas dos intestinos foram feitas em microscopia de luz, em sistema analisador de imagens (Motic Images Plus 2.0-Motic China Group Co.2006), acoplado ao microscópio (Olympus BH2 Olympus America Inc., NY, USA). Nas amostras de duodeno e ceco foi realizada a quantificação de células CD3 positivas intra-epiteliais, em toda a extensão do vilo, sendo contado 10 vilos por tratamento. Foi realizada também a relação vilo/células CD3+. Todos os resultados obtidos foram analisados pelo programa estatístico StatView for Windows Copyright© 1998 (SAS Institute Inc., NC, USA). A contagem de colônias foi transformada em Log 10 para diminuir a amplitude dos resultados. Os resultados da altura dos vilos, profundidade das criptas, relação vilo-cripta e contagem das células caliciformes foram submetidos à ANOVA (P<005) e caso as médias obtidas apresentassem diferença significativa, essas eram submetidas ao teste de Tu

【 授权许可】

CC BY-NC