Assessment of blood inflammatory response in BCG stimulated rattlesnakes (Crotalus durissus Linnaeus, 1758)

Pesquisa Veterinária Brasileira

Moreira, Silvia Bahadian²  Machado, Claudio³  Freire, Isabel M.A.²  Maciel, Patrícia Oliveira²  Silva, Luiz Cesar C.P. da²  Silva, Wellington Bandeira da¹  Goldberg, Daphne W.²  Almosny, Nádia Regina P.² 

[1] Universidade Federal Fluminense, Niterói, Brasil;UFF, Niterói;Instituto Vital Brazil, Niteroi

关键词: Crotalus durissus;    inflammation;    BCG;    hematology;    reptile.;   

DOI  :  10.1590/S0100-736X2009001200006

来源: Colegio Brasileiro de Patologia Animal-CBPA

【 摘 要 】

The high demand for anti-venom production in response to the increased number of cases of snakebite envenomation highlights the importance of raising and breeding venomous snakes in captivity. Knowledge of types of venoms and anti-venoms is of great interest to public health. The maintenance of venomous serpents in captivity started in the early twentieth century, but still nowadays it is a challenge to manage and prevent diseases in captive fauna. Hematology is commonly used for general health assessment and illness detection. However, data on serpent blood analysis are still scarce. Alterations in hematological parameters were experimentally induced in rattlesnakes by the inoculation of BCG. Based on this, hemograms can be used as a health auxiliary diagnosis method for bacterial diseases in this species. In this study, blood samples were taken from 10 healthy specimens of rattlesnakes (Crotalus durissus) born and bred in captivity in the Herpetological Division of Vital Brazil Institute. Animals were divided into two groups (group 1 and 2) with similar live weight and sex proportion, and were then inoculated subcutaneously with BCG (Bacillus Calmette-Guérin). Blood samples were taken before and after inoculation at three experimental times (days 3, 5 and 7 for group 1 and days 11, 17 and 21 for group 2). Hematological analysis was performed through semi-direct technique, blood samples were diluted in Natt and Herrick solution and smears were stained by Giemsa. Serpents from group 1 developed discrete anemia due to the inflammatory syndrome, and showed significant decrease of MCH and MCHC. Granulocytes were characterized by the presence of rough granules. The azurophils varied in shape and size and showed large amount of cytoplasmic vacuoles. The thrombocytopenia observed in group 2 suggests that these cells participate in the inflammatory process. A single individual from group 1 showed granulocytosis and a few animals showed a discrete azurophilia. In general, BCG inoculation unleashes hematological inflammatory responses characterized by the presence of thrombocytes, azurophils and granulocytes cells.Index terms: Crotalus durissus, inflammation, BCG, hematology, reptile.    INTRODUÇÃOO número de notificações de acidentes ofídicos vem aumentando a cada ano no Brasil com a espécie Crotalus durissus, responsável por cerca 9,2% do total de notificações, variando de acordo com a região (Araújo et al. 2003). Somado a isso, essa espécie tem aumentado sua distribuição e densidade no Rio de Janeiro devido ao aumento da fragmentação florestal, resultado do crescimento desordenado das cidades (Bastos et al. 2005). Os dados epidemiológicos mostram o aumento da demanda de soro antipeçonhento em todo Brasil evidenciando a importância para a saúde pública da criação de serpentes peçonhentas em cativeiro. Por esta razão o conhecimento do manejo e da clínica destes animais se torna importante a fim de permitir maior sobrevida do animal.Considerado como exame de triagem clínica, o hemograma é utilizado no auxílio ao diagnóstico, no acompanhamento clínico e no prognóstico de diversas moléstias que acometem os animais (Almosny & Monteiro 2007). Embora existam trabalhos de décadas passadas, relativamente pouco se sabe sobre hematologia e sobre o desenvolvimento da resposta inflamatória em répteis. A classificação celular nestas espécies se mostra divergente, talvez devido a comparações com espécies distantes evolutivamente como mamíferos e aves.Uma ferramenta utilizada na classificação funcional dos tipos celulares observados no sangue de cascavéis é a avaliação do comportamento celular sob diferentes estímulos patológicos experimentalmente induzidos ou naturalmente observados. A inoculação de cepas atenuadas de Mycobacterium tem sido utilizada no estudo da resposta hematológica em animais endotérmicos e ectotérmicos (Marcus et al.1975, Buddle & Young 2000, Sado & Matushima 2008). O bacilo de Calmette-Guérin (BCG) é um derivado do Mycobacterium bovis atenuado, e vem sendo utilizado hoje em dia para a imunização vacinal contra a tuberculose, como veículo recombinante para vacinas multivalentes para outras doenças infecciosas e para a imunoterapia do câncer (Nunes 2004).Sendo assim, o objetivo desse estudo foi avaliar a dinâmica leucocitária e eritrocitária, decorrente do processo inflamatório induzido pela inoculação de BCG em cascavéis, através de exames hematológicos seriados realizados nos animais antes e depois de inoculados.  MATERIAL E MÉTODOSForam utilizadas 10 serpentes da espécie Crotalus durissus, machos e fêmeas, nascidos e criados na Divisão de Herpetologia do Instituto Vital Brazil (IVB, Niterói, RJ) com idade de três a quatro anos, com a finalidade principal de extração de veneno para produção de soro antipeçonha. Os animais foram selecionados após constatação de sanidade por exame físico e observação de agressividade normal para a espécie. Os animais selecionados foram divididos em dois grupos (Grupo 1 e 2) de forma a manter a homogeneidade em relação ao peso e proporção sexual entre eles. Todos os animais foram excluídos da rotina de extração de veneno no período do experimento.Os animais foram acondicionados individualmente em caixas retangulares de polipropileno leitoso (50x35x16cm, comprimento x largura x altura), devidamente identificadas e mantidas dentro de uma sala à temperatura ambiente (25-30°C). Antes e durante o experimento, os animais foram regularmente alimentados uma vez ao mês com dois camundongos de biotério e com livre acesso a água, conforme rotina do serpentário. Quarenta dias antes de se iniciar o experimento, preconizou-se o uso de Ivermectina (Ivomec®), Levamizole (Ripercol®) e Fipronil 10% (Frontline® Spray) segundo Carpenter et al. (2004) para controle de endoparasitas e ectoparasitas.Coletas de sangue para realização dos exames controle, caracterizando os valores de normalidade para os espécimes estudados, foram realizadas nos dois grupos, 14 dias antes da inoculação. Para indução do estímulo inflamatório, foram utilizados 0,05ml de Imuno-BCG (Bacilo Calmette-Guerin, Fundação Ataulpho de Paiva), na concentração de 80 mg/ml. A inoculação foi realizada por via intramuscular na região dorsal, do lado direito, aproximadamente entre a junção do terço cranial e medial do animal. O Grupo 1 foi submetido à coleta de sangue no 3º, 5º, e 7º dias após serem inoculados com BCG e o Grupo 2 no 11º, 17º e 21º dias pós-inoculação.As amostras sanguíneas foram coletadas através de punção da veia coccígea ventral (Campbell 2004, Almosny & Monteiro 2007). Foi coletado cerca 0,5ml de sangue de cada animal utilizando agulha 20x5,5 e seringa de 1ml, que foram armazenados em frasco plástico de fundo cônico (Eppendorf®) previamente rinsados com heparina sódica 5.000UI/ml (Liquemine®). Esfregaços sanguíneos sem anticoagulante foram confeccionados no momento da coleta.Para contagem global dos tipos celulares preconizou-se a diluição do sangue em líquido de Natt e Herrick (Natt & Herrick 1952) na proporção de 1:100 e contagens na câmara de Neubauer® Improved, com auxílio de microscópio óptico, em aumento de 400 vezes. As hemácias foram contadas concomitantemente com a contagem conjunta dos leucócitos e trombócitos. Os valores obtidos foram multiplicados pelo fator de correção, sendo os resultados expressos em número de células/mm3. O volume globular foi determinado pela técnica do microhematócrito que consiste na centrifugação de tubos capilares preenchidos com sangue a 10.000 rpm por 5 minutos segundo Campbell (2004). As dosagens de hemoglobina foram realizadas pelo método da cianometahemoglobina, segundo Campbell (2004). Uma solução com 5ml de reagente de cor (Labtest Diagnóstica®) e 20µl de sangue total foi preparada para reação colorimétrica, sendo centrifugada a 3.000rpm por 5 minutos, a fim de precipitar o núcleo das hemácias (Raskin 2000, Campbell 2004, 2006). A absorbância da amostra foi medida em analisador bioquímico semi-automático Bioplus 2000® em 540nm. O fator de calibração utilizado (36,20) foi obtido com o padrão de hemoglobina. Os esfregaços sanguíneos foram fixados por dois minutos em metanol e imersos por trinta minutos em solução de Giemsa (Merck®) a 5% em água destilada.A leucometria específica foi realizada em microscopia óptica, aumento de 1000 vezes, seguindo-se um padrão de leitura em guarda grega em suas duas bordas. Foram contados 100 leucócitos, os quais foram diferenciados em basófilos, granulócitos, azurófilos, linfócitos e monócitos adaptando-se a nomenclatura descrita por Montali (1988), Troiano et al. (1997) e Almosny & Monteiro (2007). Uma contagem paralela de trombócitos foi realizada durante a contagem dos leucócitos a fim de determinar a proporção entre estes dois tipos celulares.Para permitir uma visão geral dos perfis estudados na população, foi calculado a média e o desvio-padrão de cada variável analisada na pesquisa. Para verificação de diferenças significativas entre os grupos (p<0,01), foi realizada análise de variância (ANOVA) para as variáveis entre os grupos antes da inoculação.As distribuições das variáveis foram submetidas aos testes estatísticos de Qui-quadrado, Kolmogorov-Smirnov e Anderson-Darling, no intuito de se verificar sua compatibilidade com a curva de normalidade e a pertinência de aplicação de testes paramétricos ou não-paramétricos. O critério de decisão foi o de considerar incompatível com testes paramétricos qualquer distribuição que apresentasse significância (p<0,05) em pelo menos dois dos três testes aplicados. Nas variáveis com distribuições normais, foi empregado ANOVA para a verificação de diferenças significativas (p<0,05) entre as respectivas variâncias das coletas dentro dos grupos. Quando o resultado do ANOVA indicou significância, foram realizados quatro testes estatísticos (Teste de Duncan, Fisher, Scheffe e Tu

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