Detection of the genes encoding the toxin CDT, and research factors which influence the production of hemolysin in Campylobacter jejuni from poultry products

Pesquisa Veterinária Brasileira

Lovato, Maristela³  Trindade, Michele M.³  Borsoi, Anderlise²  Sierra-Arguello, Yuli M.¹  Nascimento, Vladimir P.¹  Perdoncini, Gustavo¹ 

[1] Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brazil;Universidade de São Paulo, São Paulo, Brazil;Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, Brazil

关键词:  PCR;    hemolytic activity;    ions;    chelants;    CDT;    Campylobacter jejuni.;   

DOI  :  10.1590/S0100-736X2015000800002

来源: Colegio Brasileiro de Patologia Animal-CBPA

【 摘 要 】

:Thermophilic members of the Campylobacter genus are recognized as important enteropathogenics for humans and animals. The great variety of ecological habitats, such as water, food and milk, may promote new virulence factors. To detect the encoding genes distending cytolethal toxin (CDT) by PCR and study the hemolytic activity with influence of chelation solutions and ions, 45 Campylobacter jejuni samples from poultry production origin were used to perform the hemolytic research. To check the influence of chelation agents and solution of ions in the hemolytic activity, samples of C. jejuni strains were grown in tryptone soy broth TSB containing chelation agents separately EDTA, acetic acid, CaCl2, MgCl2 and FeCl3 ions solutions in microaerophilic atmosphere and then streaked on 5% sheep blood tryptic soy agar (TSA). To perform the detection of cdtA, cdtB and cdtC genes the technique of Polymerase Chain Reaction (PCR) was used in 119 samples of C. jejuni from poultry production origin. We found 40% of samples showing hemolysis after growing with TSB. Only the acetic acid showed reduction in hemolysis. The prevalent gene profile was cdtABC in 37.8 % of the samples. It was observed that the results showed the presence of C. jejuni strains with virulent potential, due to presence of the CDT toxin genes and the hemolytic activity, which showed in vitro reduced when acetic acid was added.Index Terms: PCR; hemolytic activity; ions; chelants; CDT; Campylobacter jejuni.IntroduçãoQuando se considera o alimento de origem avícola, deve-se avaliar o estado sanitário dos plantéis, o que reflete na qualidade do alimento produzido. Frangos de corte estão entre os principais carreadores de patógenos em abatedouros e apresentam alta correlação com a contaminação cruzada por Salmonella spp. e Campylobacter sp. (Fao/Who 2009). A legislação atual do Brasil regula o controle de Salmonella spp. em carcaças de frangos (Brasil 2003), porém para Campylobacter sp. não há legislação vigente para sua avaliação e que regulamente seu controle tanto em lotes de frangos de corte como em seus produtos.A família Campylobacteraceae é composta de três gêneros: Campylobacter, Arcobacter e Sulfuropirullum. O gênero Campylobacter possui uma taxonomia complexa e que ainda se encontra em evolução (Feistel et al. 2013). As espécies Campylobacter jejuni, C. coli, C. lari, C. upsaliensis e C. helveticus formam um grupo geneticamente próximo e são frequentemente isolados de animais e do homem com diarreia (Silva et al. 2011). Dentre as espécies enteropatogênicas, C. jejuni recebe maior atenção, estimando-se que cerca de 90% dos casos de campilobacteriose em humanos sejam causados por esse agente bacteriano (Wassenaar & Newll 2000). São tipicamente bactérias microaerófilas, requerem cultivo em 5 a 7% de O2 e em 3 a 5% de CO2. O cultivo é difícil, sendo altamente sensível às condições ambientais como temperatura, ressecamento e tensão de oxigênio. A faixa de pH ótimo está em 6,5 a 7,5. Em função da produção ou não da catalase, as espécies do gênero dividem-se em dois grupos, sendo o grupo das produtoras de catalase onde se encontram as espécies importantes do ponto de vista patogênico. Quanto à capacidade de crescimento acima da temperatura de 37°C, algumas espécies apresentam um crescimento preferencial a 42°C, pertencendo ao grupo chamado termofílico ou termotolerante ao qual fazem parte espécies envolvidas nos processos gastroentéricos (Carvalho 2007, Back 2010).As bactérias termofílicas pertencentes a este gênero, entre eles C. jejuni, representam um dos mais importantes enteropatógenos para a Saúde Pública, principalmente, nos países desenvolvidos. Nos Estados Unidos da América (EUA) foram estimados mais de 845 mil casos de campilobacteriose em 2011, colocando este micro-organismo na lista dos cinco patógenos que mais causam doenças de origem alimentar no país, estando atrás somente de Norovírus e Salmonella spp. (Scallan et al. 2011), com o custo estimado de 1,7 bilhões de dólares com tratamento dos pacientes infectados por Campylobacter (Bessède et al. 2014). No Reino Unido foram estimados mais de 320.000 casos de gastroenterites causadas por Campylobacter spp., somente na Inglaterra e País de Gales no ano de 2008 (FSA 2011) e para a totalidade dos países da União Europeia, dados da European Food Safety Authority (FSA 2011) descrevem que ocorrem anualmente nove milhões de casos de campilobacteriose humana, que resultam em custos totais anuais de 2,4 bilhões de Euros.O reservatório natural de Campylobacter são as aves que podem eliminar em cada grama de fezes, quantidades superiores a 106 bactérias, revelando sua importância na disseminação para o ambiente (Altekruse et al. 1994). A preocupação está no potencial das aves em transmitir ao homem através dos alimentos de origem animal. O consumo de frangos e derivados de aves representa a forma mais comum de aquisição da gastroenterite mundialmente, estimando-se sua implicação em 50 a 70% das infecções esporádicas (Canals & Rosell 2002). Trabalhos realizados no Brasil demonstram frequência elevada dessa bactéria em produtos avícolas. No Rio Grande do Sul Boufleur (2009) encontrou positividade em 61,1% em amostras frescas de fígado, coração, moela e asa coletados em supermercados. No Rio de Janeiro, Medeiros (2011) detectou a presença de Campylobacter sp. em 70% das amostras oriundas de carcaças refrigeradas. Perdoncini (2012) analisou carcaças após o chiller e, 72% das amostras estavam contaminadas por Campylobacter sp., deste total 82% era composto por C. jejuni e 8% por C. coli.Quando da infecção por Campylobacter no homem, a reação inflamatória e a bacteremia são muitas vezes observadas e sugerem fortemente que a invasão celular é um importante passo no mecanismo patogênico, embora a habilidade e a intensidade de invasão de Campylobacter pareça ser cepa-dependente (Van Vliet & Ketley 2001). Um dos principais fatores de virulência relacionados à patogênese do Campylobacter spp. (C. coli, C. fetus, C. jejuni e C. lari) em infecções animais e humana é denominado Toxina Citoletal Distensiva (CDT) (Martinez et al. 2006). A CDT é determinada por um cluster de três genes adjacentes cdtA, cdtB e cdtC os quais codificam, respectivamente, proteínas de 30, 29 e 21 kDa (Lara-Tejero & Galán 2001). A proteína produzida pelo gene cdtB potencializa o bloqueio do ciclo celular; e as proteínas dos genes cdtA e cdtC transportam a proteína do cdtB e a interiorizam na célula hospedeira. Uma vez dentro da célula a proteína cdtB entra no núcleo e exibe uma atividade de corte no DNA dupla fita. As células eucarióticas respondem aos cortes no DNA, bloqueando a fase G2/M da divisão celular, induzindo uma distensão citoplasmática que leva à morte da célula (Dasti et al. 2010). A presença dos três genes de cdt é requerida para plena atividade da toxina (Asakura et al. 2007). No entanto, mutações podem ocorrer nos genes cdtA, cdtB e cdtC causando perda da função em alguma das três subunidades, impedindo a célula bacteriana de induzir citoxicidade (Smith & Bayles 2006).Outro fator de virulência discutido em C. jejuni é a produção de hemolisinas. Van Vliet & Ketley (2001) relatam a existência de genes contendo domínios para citotoxina hemolítica que, diferentemente de muitas outras toxinas, não é internalizada pelas células, atuando como agente ativo de membranas levando à lise e morte celular, principalmente de eritrócitos. Hemolisinas não são líticas apenas aos eritrócitos, causam danos também aos fibroblastos, plaquetas, monócitos, granulócitos e células endoteliais e do miocárdio (Rowe & Welch 1994). Já tendo sido documentada a Síndrome urêmica hemolítica como uma complicação de gastroenterite por C. jejuni em humanos (Chamovitz et al. 1983). Embora Campylobacter não seja considerado hemolítico em ágar sangue, algumas cepas apresentaram atividade hemolítica (Misawa et al. 1995). Em 1993, Hossain et al. analisaram a atividade hemolítica em diferentes eritrócitos na tentativa de avaliar a cinética de ativação da hemolisina produzida por C. jejuni. Em 1995, Misawa e colaboradores pesquisaram as condições ideais (temperatura da cultura, pH médio, concentração de CO2, período de incubação, meio utilizado) e a frequência da produção de hemolisinas em amostras de C. jejuni de origem humana e não humana, obtendo em 100% das mesmas, atividade hemolítica.Em decorrência da importância de C. jejuni na saúde pública o presente trabalho teve por objetivo pesquisar a atividade hemolítica e influência de soluções quelantes e de íons nesta atividade e, detectar a presença dos genes cdtA, cdtB e cdtC codificantes da toxina CDT em amostras de C. jejuni de origem avícola.Material e MétodosProcedência das amostras de campoAs amostras de Campylobacter jejuni estudadas foram oriundas da bacterioteca do Centro de Diagnóstico e Pesquisas em Patologia Avícola da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (CDPA/UFRGS), provenientes de isolados de matadouros-frigoríficos de aves, sob Inspeção Federal.Manutenção das amostrasAs amostras de C. jejuni estavam estocadas em tubos contendo Caldo Brucella, acrescidas de 25% de glicerol e mantidas em biofreezer a temperatura de -80°C. As amostras foram recuperadas através do enriquecimento em Caldo Bolton, cultivadas em ágar Carvão Cefoperazone Desoxicolato modificado mCCDA e incubadas por 48h em temperatura de 41,5°C, sob ambiente de microaerofilia (Microaerobac - Probac®).Detecção da atividade hemolíticaPesquisa de hemolisina em meio sólido. Foram utilizadas 45 amostras de C. jejuni, as quais foram cultivadas em caldo Triptona de soja (TSB) e incubadas a 41,5°C por 48h. Após o crescimento bacteriano, as amostras foram semeadas em Ágar tríptico de soja (TSA) contendo 5% de sangue de ovino. O resultado foi considerado positivo quando observada a presença de halo hemólise ao redor ou sob as colônias. A leitura foi realizada no segundo dia de incubação em atmosfera de microaerofilia comercial (Microarebac - Probac®), segundo metodologia descrita por Misawa (1995).Influência da condição de cultivo na detecção de atividade hemolítica com quelantes e soluções de íons. Para verificar a influência de agentes quelantes e solução de íons na expressão da atividade hemolítica, as amostras de C. jejuni foram cultivadas em TSB contendo separadamente os quelantes EDTA (etilenoadiamina-tetra ácido acético, Synth - 5mM) e FeCl3 (Cloreto férrico - 5mM) (Baratéia et al. 2001); ácido acético (Sigma - 100g); solução de íons CaCl2 (Cloreto de cálcio - 10mM)e MgCl2 (Cloreto de Magnésio - 10mM) (Boehm et al. 1990) a 41,5°C por 48h em atmosfera de microaerofilia comercial. Após a incubação as amostras foram semeadas, como descrito anteriormente. Como controle dos testes foi utilizado somente o caldo TSB sem inoculação bacteriana, acrescido dos agentes químicos em teste.Detecção dos genes cdtA, cdtB e cdtC através da técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)A obtenção do DNA bacteriano de 119 amostras de C. jejuni foi realizada através de lise térmica seguindo protocolo de Blanco et al. (1997). Foram utilizadas como controle positivo a cepa C. jejuni ATCC 33560 e como controle negativo uma cepa de Arcobacter sp. Os primers ou oligonucleotídeos utilizados foram baseados em trabalhos anteriores (Datta et al. 2003, Wieczorek & Osek 2008), sendo cdtA F 5' CCTTGTGATGCAAGCAATC 3' - cdtA R 5' ACACTCCATTTGCTTTCTG 3'; cdtB F 5' CAGAAAGCAAATGGAGTGTT 3' - cdtB R 5' AGCTAAAAGCGGTGGAGTAT 3' e cdtC F 5' CGATGAGTTAAAACAAAAAGATA 3' e cdtC R 5' TTGGCATTATAGAAAATACAGTT 3'.A pesquisa dos genes cdtA e cdtC foram realizadas de acordo com descrito por Datta et al. (2003) adaptando a concentração MgCl2 para 1mM e a pesquisa do gene cdtB foi realizada como descrita por Wieczorek & Osek (2008) com concentração de MgCl2 adaptada de 1,5mM. Após amplificação em Termociclador (Biocycler - Peltier Thermal Cycler MJ96+MJ96G), os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese realizada em gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio. Os fragmentos do DNA amplificados foram visualizados em trans-iluminador ultravioleta, para identificar bandas de 370pb para o gene cdtA, 620pb para o gene cdtB e 182pb para o gene cdtC.Análise estatísticaOs dados de presença de halos de hemólise versus as soluções quelantes e ou de íons foram analisados utilizando-se o teste de comparação de médias Tu

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