Kayu putih (Melaleuca cajuputi) merupakan tumbuhan yang banyak dijumpai di pesisir pantai Kota Singkawang. Tumbuhan ini berpotensi digunakan untuk mengobati diare. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri daun kayu putih yang berasal dari Kota Singkawang terhadap bakteri uji Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Metode yang digunakan untuk isolasi minyak atsiri yaitu distilasi uap, sedangkan uji aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi sumuran. Hasil isolasi minyak atsiri daun kayu putih menghasilkan rendemen sebesar 0,55%. Analisis GC-MS menghasilkan 26 puncak senyawa dengan 2 senyawa utama yaitu 1,8 sineol sebesar 71,96% dan alpha-terpineol sebesar 11,44%. Hasil uji aktivitas antibakteri minyak atsiri daun kayu putih terhadap bakteri E. coli dan S. aureus menghasilkan aktivitas yang tergolong lemah. Diameter zona hambat terhadap bakteri E. coli dengan konsentrasi 50µg/µl menghasilkan zona sebesar 4,39 mm, sedangkan pada bakteri S. aureus yaitu sebesar 4,62 mm.