AMP-activated protein kinase에 의한 Retinoic acid receptor-related orphan receptor α의 인산화 연구

AMPK;RORα;in vitro kinase assay;phosphorylation;615

약학대학 약학과 ;

University:서울대학교 대학원

关键词: AMPK;    RORα;    in vitro kinase assay;    phosphorylation;    615;   

Others  :  http://s-space.snu.ac.kr/bitstream/10371/133436/1/000000004196.pdf

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来源: Seoul National University Open Repository

【 摘 要 】

레티노산 관련 고아 핵 수용체 (RORα)는 많은 대사관련 유전자의 발현을 조절함으로써 다양한 대사 경로에 중요한 역할을 수행한다. 이와 관련하여 이전에, RORα가 지방이나 탄수화물 대사에 중요한 조절 인자들 중 하나인 AMPK와 밀접한 연관성을 가진다는 것을 확인한 바 있다. 지속적으로 활성을 가지는 형태의 AMP-의존성 인산화 단백질(AMPK)을 과 발현되도록 하거나, AMPK를 활성화 시키는 물질인 AICAR를 처리하였을 경우, HepG2 세포에서 RORα의 인산화가 증가하였다. 그러나 이 현상이 AMPK가 직접적으로 RORα를 인산화하여 일어난 것인지는 확실하지 않았다. 본 연구에서는 이를 분명히 하기위해 대장균에서 RORα 단백질을 발현 후 정제한 것을 이용하여, 생체 외 실험법으로 인산화 실험을 수행하였다. 전체 RORα 단백질에서 N-말단에 GST, C-말단에 His-tag이 발현되도록 설계된 클로닝 운반체를 제작하였다. 이 클로닝 운반체가 대장균 균주인 BL21에 형질전환 되도록 하여, 섭씨 30 도에서 6 시간 동안 0.5 mM 농도의 IPTG로 GST-RORα-His 단백질의 발현을 유도하였다. 이어 His-tag 친화성 관크로마토그래피를 이용해 정제한 결과, 약 90 퍼센트 정도의 순수한 GST-RORα-His 단백질을 얻어내었다. 생체 외 인산화 실험에서, GST-RORα-His 단백질을 AMPK 단백질과 함께 AMPK가 활성화 되는 조건인 AMP가 낮은 비율(AMP 대비 ATP 비율 0.5)을 만들어 반응을 한 결과, GST-RORα-His의 세린 잔기에서 인산화가 일어나는 것이 관찰되었다. 여기에서 AMPK에 의해 증가된 GST-RORα-His의 인산화는 AMPK의 활성 저해 물질인 compound C가 함께 처리된 경우에 억제되었다. LC-MS를 이용하여 GST-RORα-His 인산화 되는 잔기를 분석한 결과, 66번과 139번 세린 잔기에서 인산화가 일어나는 것이 확인되었다. 그 중 66번을 알라닌으로 변이시킨 RORα로 AMPK를 활성화 시킨 상태에서 전사 활성을 측정해 본 결과, 그 활성 정도가 정상 RORα에 비해 증가 폭이 낮은 것으로 보였다. 그러나 66번 세린잔기 하나만 변이시킨 RORα은 세포 외 실험에서 여전히 AMPK에 의해 인산화가 보였다. 이러한 결과들은 AMPK는 RORα의 여러 세린 잔기를 인산화 할 수 있으며, 그로 인해 RORα의 전사 활성을 변화 시킬 수 있다는 것을 보여준다.앞으로, 아직 명확히 밝혀지지 않은 AMPK에 의한 RORα의 인산화 위치와 세린 139번의 변이에 대한 연구, 그리고 그로 인한 생화학적 기능 변화 및 기전에 대한 연구가 진행되어야 할 것이다. 이는 훗날 다양한 질병에서 나타나는 RORα의 상태를 이해하는데 도움을 줄 것이다.