Desenvolvimento e padronização do Dot-ELISA usando peptídeos recombinantes para o diagnóstico sorológico de Neospora caninum

Pesquisa Veterinária Brasileira

Leandro S. Araujo¹  Joaquin H. Patarroyo¹  Jose D. Guimarães¹  Rafael D. Blanco¹  Jose A. Cardona¹  Adriana M. Henao¹  Cintia F. Fidelis¹  Marlene I. Vargas¹ 

[1] Universidade Federal de Viçosa;

关键词: Neosporose;    Neospora caninum;    diagnóstico;    doenças parasitarias;    hematozoários;    Dot-ELISA;    sorologia;    bovinos;   

DOI  :  10.1590/S0100-736X2014000800002

来源: DOAJ

【 摘 要 】

A neosporose é reconhecida como uma das maiores causas de aborto e perdas neonatais em bovinos de leite e corte em todo o mundo. Nos últimos anos esta doença tem atraído o interesse de pesquisadores com foco na epidemiologia e métodos eficazes de diagnóstico desta doença. No presente estudo objetivou-se desenvolver e padronizar um teste Dot-ELISA para o diagnóstico sorológico de Neospora caninum com um peptídeo recombinate como antígeno, visando o desenvolvimento de um kit para diagnóstico a campo. O peptídeo recombinante (rNcGRA1) foi desenhado com base na metodologia de genética reversa de epítopos antigênicos originados de uma proteína de grânulos densos de N. caninum, e sintetizado pela GenScript (USA). Produzido mediante o processo fermentativo em leveduras Pichia pastoris KM71. Para a padronização do Dot-ELISA, membranas de nitrocelulose de 0.22µm foram sensibilizadas com 1µL do antígeno e posteriormente os soros foram diluídos em solução de lavagem e incubados durante 1 hora. A revelação foi feita mediante a adição de Proteína G marcada com peroxidase por 30 minutos, seguido da solução reveladora a base de 3,3’-Diaminobenzidine (DAB). Logo após a padronização foram testados 44 soros bovinos diagnosticados por imunofluorescência indireta (RIFI), obtendo-se uma concordância nos resultados do teste de 95,5% e uma sensibilidade e especificidade de 100% e 92% respectivamente. Quanto ao Kit para diagnóstico a campo na Plataforma Tecnológica RapidFlow-Through Miriad®, o peptídeo rNcGRA1 apresentou marcações visíveis ao reagir com os soros positivos, e não apresentou marcações usando os soros negativos. Este estudo é o primeiro a utilizar peptídeos recombinantes e mostrar-se eficiente para o diagnóstico sorológico de bovinos naturalmente infetados por N. caninum.

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