Otimização da técnica da PCR para a detecção de Actinobacillus pleuropneumoniae

Ciência Rural

Karina Koerich De Souza¹  Catia Silene Klein²  Jalusa Deon Kich²  Arlei Coldebella²  Geraldo Camilo Alberton¹ 

[1] ,Universidade Federal do Paraná Departamento de Medicina Veterinária Curitiba PR ,Brasil

关键词: PCR;    gene cpx;    tonsila;    Actinobacillus pleuropneumoniae;    pleuropneumonia suína;    PCR;    gene cpx;    tonsilar tissue;    Actinobacillus pleuropneumoniae;    porcine pleuropneumonia;   

DOI  :  10.1590/S0103-84782008000800023

来源: SciELO

【 摘 要 】

A utilização de métodos moleculares baseados em PCR é fundamental na detecção do Actinobacillus pleuropneumoniae, sendo capaz de identificar a infecção antes do estabelecimento da doença no rebanho. Estes métodos apresentam maior sensibilidade quando comparados com métodos tradicionais de isolamento bacteriano, mas podem sofrer influência de substâncias que reduzem a especificidade do teste e proporcionam o aparecimento de amplificações inespecíficas. No intuito de reduzir as amplificações inespecíficas, observadas quando aplicada a PCR para o gene cpx em amostras de tecido tonsilar, procedeu-se a otimização da técnica, na qual foram analisados o efeito do pré-cultivo bacteriano e as diferentes temperaturas de anelamento dos iniciadores e foi introduzido, no protocolo, um anticorpo que se liga na enzima Taq DNA Polimerase, aumentando a especificidade do teste. Paralelamente, foi realizado um experimento para verificar o efeito inibidor do tecido tonsilar sobre os resultados da PCR. Para isso, porções de tonsila de animais negativos para A. pleuropneumoniae foram contaminadas artificialmente com a amostra referência do sorotipo 5B. A adição do anticorpo para a enzima Taq DNA Polimerase e o aumento da temperatura de anelamento dos iniciadores para 57°C diminuiu o aparecimento de amplificações inespecíficas. Os resultados obtidos no experimento demonstraram que o tecido tonsilar possui efeito inibidor nas amplificações da PCR. Além disso, a amplificação depende de, no mínimo, 675 UFC presentes na alíquota da amostra usada na PCR (equivalente a 1,35 x 10(5) UFC mL-1), assim, amostras de fragmentos de tecido de infecções iniciais e/ou com poucas células podem apresentar resultados falsos negativos.

【 授权许可】

CC BY   
 All the contents of this journal, except where otherwise noted, is licensed under a Creative Commons Attribution License