Comparison of two methods of equine bone marrow aspiration and two solutions for mononuclear cell isolation

Pesquisa Veterinária Brasileira

Tognoli, Guilherme K.¹  Dumont, Cinthia B.S.⁴  Varanda, Luis F.O.⁴  Godoy, Roberta F.²  Moraes, Júlia M.³  Bravo, Martha O.⁴  Rosa, Mariana C.⁴  Araújo, Pollyanna C.⁴ 

[1]Faculdades Integradas do Planalto Central, Brasília, Brasil

[2]University College of London, Brockley Hill Stanmore, United Kingdom

[3]Universidade Federal de Goiás, Jataí, Brazil

[4]Universidade de Brasília, Brasília, Brazil

关键词:  Bone marrow;    mononuclear cell isolation;    cell therapy;    cellular viability;    DMEM;    medullar fraction;    PBS;    horses;   

DOI  :  10.1590/S0100-736X2016000300015

来源: Colegio Brasileiro de Patologia Animal-CBPA

【 摘 要 】

:The aim of this study was to evaluate mononuclear cells fraction (MCF) concentration and viability from different techniques of bone marrow (BM) aspiration and processing in horses. Five adult horses, healthy and of unknown breed were evaluated. BM was obtained from sternum bone, according two protocols: in aspiration A, 10mL of heparin solution was used inside the syringe and BM was aspirated; in aspiration B, 10mL of heparin solution was injected into the BM, and aspiration was done after 20 seconds. All the animals were submitted by both protocols realized in sequence, without a gap between the procedures. After MCF isolation, of BM samples obtained from A and B aspiration, each sample was divided into two tubes; one contained DMEM solution and the other with PBS solution. Therefore, interchanging the aspiration protocol and the dilution solution, four sample tubes were obtained for each horse. The tubes were centrifuged and the pellet was homogenized with the respectively solution to obtain the final volume of 100μL. Cellular concentration and viability were determined to obtain the FCM medium concentration. For both solutions, the aspiration B had higher numeric values comparing with aspiration A; however, it was not significant (p>0.05). This tendency is attribute for the less BM coagulation observed in the aspiration B, suggesting greater improvement of MCF. No difference (p>0.05) was found between DMEM and PBS solution, indicating that both do not alter the cell viability. The protocols used for BM aspiration and MCF isolation were efficient for application in equine cellular therapy.Index Terms: Bone marrow; mononuclear cell isolation; cell therapy; cellular viability; DMEM; medullar fraction; PBS; horsesIntroduçãoA descoberta da aplicabilidade das células-tronco adultas (CTA) aumentou o interesse pelo uso terapêutico desse tipo celular (Parekkadan 2010), a qual tem sido utilizada rotineiramente em algumas áreas da Medicina Veterinária, principalmente em tratamento de injúrias do sistema músculo esquelético de equinos (Koch et al. 2009, Varanda et al. 2015). A terapia celular com uso de CTA apresenta custo elevado se comparada aos tratamentos convencionais. Porém, quando se avalia o seu elevado potencial terapêutico em injúrias do sistema locomotor e, o retorno precoce dos animais ao esporte, seu uso passa a ser considerado de custo viável (Rebelo 2010, Burk et al. 2013).Considerando-se o sucesso e o crescente uso da terapia celular em equinos, destaca-se a importância na determinação de todas as variáveis que podem influenciar na quantidade e qualidade do material biológico a ser utilizado, incluindo o método de diluição para isolamento das frações celulares dos tecidos colhidos (Koch et al., 2008, Maia et al. 2013, Barberini et al. 2014, Varanda et al. 2015). Sabe-se que há uma relação direta com o número de células obtidas nas colheitas e sua capacidade de diferenciação e viabilidade nos meios utilizados. Para que o concentrado celular promova efeitos terapêuticos benéficos, sem necessidade de cultivo celular, uma quantidade alta de CTA deve estar presente nos aspirados de medula óssea (MO) (Oliveira 2009, Maia et al. 2013, Barberini et al. 2014, Varanda et al. 2015).Em equinos os aspirados de MO podem ser feitos tanto no osso esterno, como na tuberosidade coxal (Kasashima et al. 2011, Delling et al. 2012, Adams et al. 2013, Kisiday et al. 2013, Maia et al. 2013, Barberini et al. 2014, Schnabel et al. 2014, Varanda et al. 2015). Com a colheita da MO faz-se a separação da fração de células mononucleares (FCM), na qual se obtém uma população de células-tronco mesenquimais e hematopoiéticas, o que pode ser utilizada prontamente eu expandida em cultivo. No procedimento de isolamento da FCM, normalmente utiliza-se a solução de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) como meio diluidor de células (Tognoli et al. 2009, Delling et al. 2012, Burk et al. 2013, Schnabel et al. 2014, Varanda et al. 2015), necessitando de mais opções de soluções para utilização em rotina.Tendo em vista a relevância do tema e a necessidade de estabelecer protocolos consistentes quanto ao isolamento de MO, o presente trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar a tanto a facilidade de colheita como a concentração e viabilidade da fração de células mononucleares (FCM) a partir de diferentes técnicas de colheita e processamento de medula óssea (MO) em equinos.Material e MétodosAs colheitas de medula óssea (MO) foram realizadas no Hospital-Escola de Grandes Animais da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária (FAV/UnB), e o isolamento e as contagens das FCM foram realizados no Laboratório de Reprodução e Biotecnologia FAV/UnB, Brasília, DF, de acordo com os protocolos preconizados por Tognoli et al. (2009) e Barreira et al. (2008). O experimento foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília (UnBDOC nº 75944/2008).Foram utilizados cinco equinos hígidos, previamente avaliados por exame clínico, hematológico e bioquímico, sem raça definida, de aproximadamente quatro anos de idade (4,4±0,55) e peso médio de 250 kg (±15,81). Para realização da colheita de MO, os animais foram mantidos em posição quadrupedal, contidos em bretes e sedados com cloridrato de detomidina, sob a dose de 0,02mg/kg, administrados por via intravenosa. Realizou-se tricotomia de uma área de aproximadamente 5cm x 20cm na região do osso esterno e posterior limpeza da área com iodopolividona degermante (Riodeine/Rioquima). Após identificação do local de colheita por meio de diagnóstico ultrassonográfico, compreendido entre a 4ª e a 5ª esternébra, procedeu-se anestesia local com 10mL de cloridrato de lidocaína a 2% infiltrados por injeção percutânea no local de inserção da agulha de punção de MO. Após antissepsia da área com álcool 70%, a punção de MO foi realizada com o uso de agulhas de punção medular do modelo Jamshid (Ecomed) de12 cm de comprimento e calibre 8. A agulha foi inserida em ângulo de 90º em relação ao osso, com introdução de aproximadamente cinco centímetros da agulha. Para a introdução da agulha na esternebra, se exerceu força moderada e uniforme para no sentido ventro-dorsal e em giro simultaneamente, encontrando-se resistência moderada em todo o procedimento de penetração da agulha. Uma vez fixada a agulha dentro do esterno, a MO foi aspirada com seringa de 60mL (BD Plastipak).Previamente à realização das colheitas de cada animal, preparou-se uma solução de 10.000 UI de heparina sódica diluídos em 20mL de cloreto de sódio (0,9%). A colheita de MO foi realizada sob dois protocolos, A e B no mesmo animal, sem intervalo entre as colheitas, utilizando a mesma agulha de punção fixada no osso esterno. Para a colheita A, reservou-se 10mL da solução de heparina dentro da seringa de 60mL e aspirou-se 10mL de MO, obtendo-se um total de 20mL. Em seguida, retirou-se da agulha a seringa da colheita A e colocou-se a seringa da colheita B. Para a colheita B, injetou-se 10mL da solução de heparina na esternébra, com a agulha Jamshid já inserida no osso e, após 20 segundos realizou-se a aspiração de 20mL MO ( Fig.1 ). As alíquotas obtidas foram depositadas em tubos de plástico tipo falcon de fundo cônico e volume de 50mL (Tubo Falcon/TPP). Fig.1: Procedimento de colheita de medula óssea (MO). (A) Mandril e agulha encaixados no interior do esterno. (B) Inicio das colheitas, observa-se a agulha acoplada à seringa e o conteúdo medular no interior da seringa.  As amostras foram refrigeradas em caixa de isopor com gelo a aproximadamente 8ºC e encaminhadas imediatamente para o processamento, que foi realizado exclusivamente em capela estéril de fluxo laminar. Cada amostra obtida (colheitas A e B) foi dividida em dois tubos contendo solução de separação por gradiente de densidade (Ficoll-Hypaque, Histopaque/ Sigma-Aldrich), sobre o qual a MO foi delicadamente depositada na proporção de 1:1 ( Fig.2A ). Os tubos foram centrifugados a 500 G por 30 minutos, para a separação da FCM por gradiente de concentração, sendo a fração visível na forma de um halo na suspensão em cada um dos tubos ( Fig.2B ). Fig.2: Separação por gradiente de Ficoll. (A) Amostra de medula óssea (MO) (seta grossa) depositada sobre o Ficoll (seta fina). (B) Frações celulares separadas após a primeira centrifugação, com formação de um halo visível, no qual se encontra a FCM (chave). (C) Halo da FCM em destaque (chave).  O halo de células mononucleares foi removido com auxílio de pipeta graduada e diluído na proporção 1:1 em duas soluções diferentes para a lavagem das células, sendo estes, solução de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, Invitrogen) e Tampão fosfato salino (PBS, Laborclin). Desta forma, para cada animal, obteve-se quatro tubos de amostras: colheita A diluída em DMEM, colheita A diluída em PBS colheita B diluída em DMEM e colheita B diluída em PBS. Todos os tubos foram centrifugados novamente, agora a 500 G por 10 minutos. Os sedimentos obtidos foram novamente ressuspensos no meio de escolha, DMEM ou PBS, e as amostras então centrifugadas, pela ultima vez, a 500 G por 10 minutos. Assim, os sedimentos finais foram diluídos nos respectivos meios, DMEM ou PBS, para que completassem o volume final de 100 μL de cada amostra, não sendo ressuspensos os sedimentos que já tinham 100μL. Em seguida, todas as amostras foram submetidas à quantificação e ao teste de viabilidade celular. A quantificação celular e a determinação da viabilidade da FCM obtida foi realizada por meio da mistura de 20μL de Azul de Tripan a 1% (Sigma-Aldrich) em 20μL de cada FCM em tubo Eppendorf. Após homogeneização, 20μL da mistura foram transferidos para a câmara de Neubauer para a contagem e determinação da viabilidade celular em microscopia de luz.Após a colheita de MO foi realizado curativo local com iodopolividona tópico (Riodeine/Rioquima) em todos os animais, estes foram mantidos em baias individuais e receberam antibioticoterapia sistêmica com penicilina benzatina (30.000 UI/kg/IM) em três aplicações, a cada 48 horas, e fenilbutazona (4,4mg/kg/IV), uma vez ao dia, por três dias consecutivos.Após visualização da existência de normalidade entre as variáveis com o teste de aderência Kolmogorov-Smirnov, evidenciaram-se amostras paramétricas e foi utilizada a análise de variância (ANOVA) seguida pelo Teste de Tu

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